UTSW余永豪组在ADP-ribosylation研究领域取得新突破
二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）是一种蛋白翻译后修饰，利用NAD+作为供体，PARPs（Poly ADP-ribose polymerases）作为合成酶将ADP-ribose连接到目的蛋白。与其他蛋白翻译后修饰（甲基化，磷酸化等）类似的是，二磷酸腺苷核糖基化也是可逆的过程，ADP-ribose可以被水解酶去除，例如PARG (Poly ADP-ribose glycohydrolase)【1】。作为一类已经被发现了将近六十年的蛋白翻译后修饰，二磷酸腺苷核糖基化广泛参与到DNA损伤修复，转录调控，染色体蛋白重构等重要的生物学过程【2,3】。特别是近几年，三种PARP抑制剂（Olaparib，Rucaparib和Niraparib）已经成为美国FDA批准的抗癌药物，尤其针对BRCA突变的晚期卵巢癌患者【4】。此外作为单一疗法以及与放化疗组合疗法，PARP抑制剂还在广泛的临床试验中。
然而作为一类重要的蛋白翻译后修饰，对其修饰的目的蛋白的认识却曾一度处于停滞阶段。不同于其他已经具有成熟分析方法的蛋白后修饰，二磷酸腺苷核糖基化修饰非常复杂，使得质谱技术鉴定目的蛋白及相应修饰位点存在很大的困难。主要难点体现在以下几点：
1）被修饰的蛋白含量占非常小的比例，很难检测到；2）修饰异质性很高，连接到目的蛋白上的PAR链长度从1到200不等，并且可以以线性或者分支形式延伸，意味着后续质谱分析时缺乏固定的质量变化；3）修饰形成的化学键非常不稳定，在质谱技术片段化过程中很容易分解，并且产生的修饰多肽为酸性，很难被离子化；4）目的蛋白被修饰的氨基酸位点种类很多，包括谷氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，丝氨酸等，很难用一种广谱的方法鉴定所有被修饰的氨基酸位点。
2013年，美国德克萨斯西南医学中心余永豪组研究人员开发了针对天冬氨酸、谷氨酸修饰位点的二磷酸腺苷核糖基化蛋白质组的鉴定方法。基本原理为天冬氨酸/谷氨酸与ADP-ribose形成的酯键很容易被羟胺（NH2OH）攻击，产生一个具有15.0109道尔顿大小的衍生物，以此来去除复杂的PAR链（下图）。
此项研究共鉴定到340个目的蛋白包含1048个被修饰位点，发表在Nature methods【5】。运用定量蛋白质组学结合羟胺衍生的方法，余永豪实验室团队进一步大规模表征了对于PARP抑制剂敏感的二磷酸腺苷核糖基化修饰位点, 揭示了不同的PARP抑制剂对下游的敏感位点的差异分布。特别值得一提的是，此前的一个被认为是PARP抑制剂的化合物Iniparib, 完全不具有影响二磷酸腺苷核糖基化修饰。此化合物被证实不是一个真实的PARP抑制剂，而所有针对此化合物的临床试验已经停止【5】。
此质谱技术的建立，对于推动ADP-ribosylation领域的发展有着重要的作用。2016年，余永豪组与Lee Kraus组合作，在Science上发表了题为“Chemical genetic discovery of PARP targets reveals a role for PARP-1 in transcription elongation”的研究论文。此项工作合成了与NAD+类似物结合的多种PARPs（PARP1/2/3），分别与细胞核提取物孵育，在体外完成ADP-ribosylation反应，并运用上述质谱方法，来鉴定PARP1/2/3各自的底物以及相应的修饰位点。研究人员发现，PARP1可以修饰调控RNA聚合酶II活动的重要蛋白复合体NELF (Negative Elongation Factor)，使其脱离RNA，从而抑制其发挥功能，揭示了PARP1在转录延伸过程中的作用。此项研究可以扩展到多个PARP家族成员，在蛋白质组水平上研究每一个PARP成员如何响应细胞信号刺激【6】。
近日，余永豪组的最新成果“A Cell Line-Specific Atlas of PARP-Mediated Protein Asp/Glu-ADP-Ribosylation in Breast Cancer”在Cell reports上在线发表。此研究同样是以上述质谱方法为基础，在不同类型乳腺癌模型中（良性乳腺肿瘤细胞MCF10A以及八种乳腺癌细胞，包括雌激素受体阳性乳腺癌细胞、人类表皮生长因子受体2阳性乳腺癌细胞以及三种受体阴性乳腺癌细胞）分析ADP-ribosylation谱图。这是首次在不同细胞背景下，在蛋白质组学水平比较PARP激活程度和下游信号通路，对于深刻理解PARP在细胞压力反应以及作为抗癌药物靶点方面有着重要的影响。
该项研究的主要发现包括：
1）PARP在不同乳腺（癌）细胞中激活的程度不同。人们普遍认为DNA损伤是激活PARP的主要途径，然而此项研究结果显示，即使在相同诱导DNA损伤的条件下，MCF10A细胞具有最高的PARP活性，而三种受体阴性的乳腺癌细胞类型则具有相对较弱的PARP活性。这可能部分解释了在临床上三种受体阴性的乳腺癌病人对化疗药物比较敏感的现象（此类型乳腺癌病人的PARP活性不能被有效的激活，无法完成DNA损伤的修复功能，从而导致细胞死亡）；
2）靶蛋白在不同乳腺（癌）细胞中被修饰的程度不同。此研究共鉴定了320个目的蛋白，为了更好的说明目的蛋白在不同细胞系的修饰到底是源于蛋白表达的特异性还是修饰调节的特异性，研究人员同时利用TMT（Tandem Mass Tag）质谱技术分析了目的蛋白在九个乳腺（癌）细胞中的表达水平，进而将ADP-ribosylation修饰谱和蛋白表达谱做相关性分析，发现一些蛋白，如GATA3，一个在乳腺管腔细胞分化过程中发挥重要作用的转录因子，其在雌激素阳性乳腺癌细胞中的特异性修饰是由表达特异性决定的。而另外一些蛋白，如THOC4，作为调节mRNA出核的重要蛋白，其在乳腺癌细胞中的高修饰水平则并不是由特异性表达所导致，而更可能是被特异性的修饰调节所影响。
3）此外，该研究还发现在MDA-MB-468细胞中，大量核糖体蛋白被特异性修饰。结合80S核糖体结构信息，研究人员推测核糖体蛋白被修饰可能会影响核糖体亚基间的组装。
该研究成果作为重要的资源信息，促进了ADP-ribosylation领域更好的认识PARP上游调节因子和下游输出信号，对于理解其在生理病理条件下的作用有着深刻的影响。此外，该研究对将来开发基于二磷酸腺苷核糖基化的来预测PARP抑制剂敏感性的生物标记物同样有着重要的意义。
据悉，余永豪课题组博士后甄园丽为文章第一作者，余永豪教授为文章通讯作者。余永豪实验室主要开发基于质谱的蛋白质组学技术，然后用这个平台研究蛋白翻译后修饰、信号传导以及癌症和代谢类疾病。课题组主要的生物学方向有两大块：mTOR 信号通路；PARP与DNA 损伤修复。文末附有余永豪课题组博后招聘信息。
参考文献：
1. Kraus, W. L., PARPs and ADP-Ribosylation: 50 Years ... and Counting. Molecular cell 2015, 58 (6), 902-10.
2. Tallis, M.; Morra, R.; Barkauskaite, E.; Ahel, I., Poly(ADP-ribosyl)ation in regulation of chromatin structure and the DNA damage response. Chromosoma 2014, 123 (1-2), 79-90.
3. Liu, C.; Vyas, A.; Kassab, M. A.; Singh, A. K.; Yu, X., The role of poly ADP-ribosylation in the first wave of DNA damage response. Nucleic Acids Res 2017, 45 (14), 8129-8141.
4. Weil, M. K.; Chen, A. P., PARP inhibitor treatment in ovarian and breast cancer. Current problems in cancer 2011, 35 (1), 7-50.
5. Zhang, Y.; Wang, J.; Ding, M.; Yu, Y., Site-specific characterization of the Asp- and Glu-ADP-ribosylated proteome. Nat Methods 2013, 10 (10), 981-4.
6. Gibson, B. A.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Hussey, K. M.; Shrimp, J. H.; Lin, H.; Schwede, F.; Yu, Y.; Kraus, W. L., Chemical genetic discovery of PARP targets reveals a role for PARP-1 in transcription elongation. Science 2016, 353 (6294), 45-50.
德州大学西南医学中心余永豪实验室招聘博士后研究人员
德州大学西南医学中心生物化学系余永豪课题组招聘2名博士后研究人员。
http://profiles.utsouthwestern.edu/profile/126530/yonghao-yu.html
我们课题组的主要研究方向是超大规模定量蛋白质组的方法学以及信号通路的研究。实验室具有超过15年的质谱方法学开发的经验（包括样品准备，以及仪器软硬件的开发）.我们运用开发出的新方法研究蛋白质修饰的调控机制,包括磷酸化，泛素化，以及ADP-ribosylation.
实验室进而利用这些新的靶点信息，运用生物化学，分子生物学，以及动物模型来研究其在癌症以及代谢疾病中的功能。我们特别感兴趣利用这些机理信息转化而开发相关疾病的生物标记物和药物（组合用药，抗药性研究以及全新的靶向小分子/大分子药物）。
加入实验室的博士后人员会接受一整套前沿的质谱,蛋白质组学，分子生物学以及转化医学的训练，同时能参与与其他实验室以及工业界（包括制药企业和生物科技公司）广泛的合作和交流。
参考文献：
1. Zhen Y, Zhang Y, Yu Y. “A Cell Line Specific Atlas of PARP-mediated Protein Asp/Glu-ADP-ribosylation in Breast Cancer”, Cell Reports, 8, 2326, (2017)
2. Ding M, Bruick R, and Yu Y. “Secreted IGFBP5 mediates mTORC1-dependent feedback inhibition of IGF-1 signaling”, Nature Cell Biology, 18, 319, (2016).
3. Gibson BA, Zhang Y, Jiang H, Hussey KM, Shrimp JH, Lin H, Schwede F, Yu Y, Kraus WL. “Chemical genetic discovery of PARP targets reveals a role for PARP-1 in transcription elongation”, Science, (research article), 353, 45-50, (2016).
4. Zhang, Y., Wang, J., Ding, M. and Yu, Y. “Site-Specific Characterization of the Asp- and Glu-ADP-ribosylated Proteome”. Nature Methods, 10(10):981-4 (2013).
5. Yu et al., Phosphoproteomic analysis identifies Grb10 as an mTORC1 substrate that negatively regulates insulin signaling., Science, (2011).
最近工作的新闻报道:
1. http://www.utsouthwestern.edu/newsroom/articles/year-2017/personalized-breast-cancer-care.html
2. http://www.utsouthwestern.edu/newsroom/articles/year-2016/cancer-protein-kraus.html
具体要求如下：
1、具有博士学历，本科为化学，生物学或医学专业。
2、有从事生物医学的研究经验，精通分子生物学或者动物模型的候选人优先考虑。不要求之前一定有质谱或者蛋白质组学研究经历。
3、富有独立工作能力、责任心和协作精神。
请应聘者将应聘材料，包括个人简历与应聘理由陈述通过电子邮件发送至Yonghao.Yu@UTSouthwestern.edu 实验室将予严格保密，应聘信息在职位满额前一直有效.
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